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  • 产品名称:非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂
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    通用名称:非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒(荧光探针法,免提取)

    【主要成分】

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    【作用与用途】

    本试剂盒用于定性检测非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus,ASFV)特异性核酸片段,为临床监测和诊断非洲猪瘟病毒感染猪提供检测数据。非洲猪瘟确诊应根据临床症状,流行病学及实验室检测结果进行综合判定。

    【检测原理】

    本试剂盒以PCR方法结合荧光探针,核酸提取与纯化同步操作,直接通过实时监测PCR扩增产物的累积过程中荧光信号的变化对非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus,ASFV)的特异性核酸片段进行检测。

    【用法】

    1.适用样本类型本试剂盒适用于猪口鼻眼拭子、组织和血液或血清等样本中非洲猪瘟病毒的核酸检测。

    2.样本采集

    2.1口鼻眼拭子样本的采集:

    采集患病猪口鼻眼拭子样本,用专用采样棉签,适度拭抹口腔分泌物和鼻腔分泌物,眼分泌物要用拭子在眼睑下充分擦拭,迅速将棉签放入装有400μL样本稀释液的采样管中,在靠近顶端处折断棉签杆,旋紧管盖并密封,以防干燥。拭子采样以溶解到样本稀释液中可以看到组织悬浮物为最佳。

    2.2组织样本的采集:

    无菌采集病猪组织样本约0.1g,置于1.5mL无菌离心管中。

    2.3全血样本的采集:

    抽取猪静脉血1mL,置于含有适量抗凝剂的采血管中(抗凝剂建议采用EDTA或柠檬酸三钠,不应采用肝素);

    2.4血清样本的采集:

    抽取猪静脉血1mL,注入无菌收集管中,室温不超过4小时(约30-60分钟),待样本自行析出血清,或直接1600rpm离心5分钟分离出血清,转移至新的灭菌离心管中备用。

    3.保存

    采集的待测样本可立即用于检测,待测样本在2~8℃保存不应超过三天;-20±5℃保存不超过一个月;-70℃以下可以长期保存。应避免反复冻融。

    【操作程序】

    1.扩增试剂准备

    从试剂盒中取出ASFV-PCR反应液、ASFV-阴性对照品和ASFV-阳性对照品,待所有组分完全溶解后,振荡混匀5秒,瞬时离心5秒。

    2.样本处理

    2.1口鼻眼拭子样本处理:

    无需样本处理,即可直接上样。

    2.2组织样本处理:

    取约黄豆粒大小组织样本(约0.1g)置于无菌1.5mL离心管中,加入200μL样本稀释液,使用手持式组织研磨仪充分研磨至匀浆。另取出一个新的无菌1.5mL离心管,加入30μL组织样本裂解液,再加入30μL组织匀浆液,涡旋混匀,置于95℃加热5min后,12000rpm离心2min,吸取上清液5μL上样。

    2.3血液样本处理:

    全血样本处理:经样本稀释液稀释10倍后,即可直接上样;

    血清样本处理:经样本稀释液稀释5倍后,即可直接上样。

    3. 加样

    按下表体系,在0.2mLPCR管中配制反应液。试剂用毕后将剩余试剂立即放入-20±5℃保存。


    图片2


    3.1在一个分装有反应液的PCR反应管中加入5μL的ASFV-阴性对照品;

    3.2将步骤2.样本处理中取得的待检样本充分震荡混匀,然后按照5μL/样本分别加入分装有反应液的PCR反应管中;

    3.3在最后一个分装有反应液的PCR反应管中加入5μL的ASFV-阳性对照品;

    以上操作建议在冰浴条件下进行,操作完毕压紧管盖,瞬时离心。

    注:使用卡尤迪生物科技Mini8全系列荧光定量PCR仪时,建议使用无色透明的0.2mLPCR管,切勿使用有颜色,磨砂的PCR管,因为该仪器荧光读取方式为侧面激发和收集荧光信号。

    4. PCR扩增

    将反应管放置到PCR检测仪内,记录加样顺序。

    4.1按下表设置反应条件

    图片3

    4.2荧光通道的选择

    请选择FAM通道检测ASFV的核酸。

    【判定】

    1.试验成立条件:

    1.1阴性对照品FAM检测通道无S型扩增曲线;

    1.2阳性对照品FAM检测通道有典型S型扩增曲线且Ct值≤23;

    1.3阴、阳性对照品检测符合上述结果,则实验有效。

    2.结果判定

    2.1如果样本在FAM 通道有典型S型扩增曲线且Ct值≤23,则判定为非洲猪瘟病毒核酸检测阳性;

    2.2如果FAM通道有典型S型扩增曲线且 Ct值在23-30之间,则需要复检。复检结果如果样本FAM 通道仍有典型S型扩增曲线且Ct值≤30,则判定为非洲猪瘟病毒核酸检测阳性,否则为阴性。

    【注意事项】

    1.开始检测前请仔细阅读本说明书,按要求操作。

    2.各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染;实验后立即清洁工作台。

    3.扩增产物的污染,很容易出现假阳性结果。因此,临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员。

    4.本试剂盒检测结果仅供科研使用,对病猪的临床诊治应结合其症状/体征,病史,其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

    5. 检测为阴性,并不代表为非感染状态,具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判断。造成检测为阴性的可能是:①不合理样本采集、转运及处理、样本中病毒浓度过低,②未经验证的其他干扰因素如:服用抗病毒药物等。

    6.样本中DNA浓度低于本产品的最低检出限时可能出现假阴性。

    7.核酸反应液分装时应尽量避免产生气泡,上机前注意检查各荧光定量PCR反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污染仪器。

    【储存与有效期】

    本试剂盒中样本裂解液和样本稀释液应储存于 2~8℃;其余组份应储存于-20±5℃的避光条件,有效期为12个月,尽量避免反复冻融。


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